分子杂交技术的作用

一、分子杂交的原理

分子杂交（molecular hybridization）是核酸和蛋白质的1种分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其相对含量大小。其基本原理是待测单链核酸或蛋白质分子与已知序列的单链核酸或抗体（称为探针）间通过碱基配对或免疫反应形成可检出信号。在分子杂交过程中，其核心是印迹转移技术，都是先将DNA或RNA、蛋白质在凝胶上进行分离，使不同相对分子质量的分子在凝胶上展开，然后将凝胶上的样品通过影印的方式转移到固相支持物上。完成这个印迹过程以后，通过标记的探针或抗体与滤膜上的核酸或蛋白质分子进行杂交，从而判断样品中是否有与探针同源的核酸分子或与抗体反应的蛋白质分子，并推测其相对分子质量的大小。

二、分子杂交的发展历程

核酸杂交技术是Hall等在1961年开始研究的。该法的原理是探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体，检测靶序列的含量。该法费时，费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。20世纪60年代中期，Nygaard等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列奠定了基础。进入70年代，分子生物学技术有了突破性进展，固相化的poly U-Sepharose和oligo（dT）-纤维素使人们能从总RNA中分离poly A＋mRNA，可用于检测mRNA的表达量。限制性内切酶的发展和应用使分子克隆成为可能。各种载体系统的诞生，尤其是质粒和噬菌体载体的构建，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富。人们可以从基因组DNA文库和cDNA文库中获得特定基因克隆，只需培养细菌，便可提取大量的探针DNA。现在的核酸杂交技术在用非放射性物质代替放射性同位素标记探针以及简化实验操作和缩短杂交时间等方面取得了很大进展，使得核酸杂交技术越来越简便、快速、低廉和安全。把电泳分离的蛋白组分转移到固定膜上，即蛋白质印迹法（即Western杂交）。它首先是在1979年由4个研究小组（Houvet D、Renart J、Erlich H、Towbin H）报道的，但是现在普遍使用的是Towbin H等人使用的方法，这个方法实际是在1975年Southern DNA印迹法上发展而来的，因此，Western杂交不是真实意义上的分子杂交，而是通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体探针识别的蛋白质，并判断其相对分子质量。

三、分子杂交的种类

根据被检测的对象，分子杂交可分为以下几大类。（1）Southern杂交（Southern blot）：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为DNA